Full text of "USPTO Patents Application 09673274"

See other formats

P ^^^^r- ' 0 U E FRANC \^dts

— M ■ ^ - k-p/FR 99/008 43

# IN^I _

^ I Rec d 2 7 APR 1M<r

I INSTITUT
NATIONAL DE
LA PROPRIETE

INDUSTRIELLE | W 1 PQ

PCT

BR EVET D f INVENT ION

09/673274

CERTIFICAT D'UTILITE - CERTIFICAT D'ADDITION

PRIORITY
DOCUMENT

_ _ _ SUBMITTED OR TRANS MFTTFn txi

COPIE OFFICIELLE compliance with R^n™ R(b )

Le Directeur general de I'lnstitut national de la propriete
industrielle certifie que le document ci-annexe est la copie
certifiee conforme d'une demande de titre de propriete
industrielle deposee a I'lnstitut.

Fait a Paris, le 16 MARS 1959

Pour le Directeur general de I'lnstitut
national de la propriete industrielle
Le Chef du Departement des brevets

Martine PLANCHE

INSTITUT
NATIONAL D E
LA PROPRIETE
INDUSTRIELLE

SIEGE

26 bis. rue de Saint Petersbourg
75800 PARIS Cedex 08
Telephone : 01 53 04 53 04
Telecopie : 01 42 93 59 30

DB 267/250298

CTABLISSEMENT PUBLIC NATIONAL CREE PAR LA LOI N c 51-444 OU 19 AVR1L 1951

-1*

^^^^V MATIOI
^^^^ LA PW

iHsriTtrr

NATION At 01

la puormtwxm

IMDUATMIBLLI

26 bis, rue de Saint Pttersbourg
75800 Paris Cedex 08

Telephone : 01 53 04 53 04 Telecopie : 01 42 93 59 30

Reserve a I'lNPI ■

BREVET D'INVENTION, CERTIFICAT D'UTIMTE Wj/m

Code de ia propriete intellectuelte-Uvre VI H°S5?V32B

REQUITE EN DltUVRANCE

Confirmation d'un depot par teJecopte | |

Cet imprime est a rempttr a rencre noire en teltres capitals

DATE DE REMISE DES PIECES 1 5 AVR. 1998

N° D'ENREGISTREMENT NATIONAL ^ ^

. T , _y 98 04933 "

DEPARTEMENT DE DEPOT U I

DATE DE DEPOT ^ \ ^ L| . 6^ ^

1 NOM ET ADRESSE DU DEMAND EUR 0U DU MAN DATA] RE

A QUI LA C0RRESPONDANCE DOIT CTRE ADRESSfcE

RHONE -POULENC AGRO
Franck TETAZ
B.P. 9163

69263 LYON CEDEX 09

2 DEMANDE Nature du trtre de propriete industrieile

2 brevet d'invention O demande divisionnaire

demande Initiate

certifrcat tfutilite* CD transformation d'une demande

- 1 de brevet europeen Q brevet d'invention □ certificat d'utilite n°

Etablissement du rapport de recherche F] differe E immediat

Le demandeur. personne physique, requiert le paiement echelonne de la redevance P] oui non

Trtre de H invention (200 caracteres maximum)

n°du pouvoir permanent references du correspondent telephone

6229 PH 98015 4 72 85 25 92

date

Apgne codant pour 1 'hSliomicine, protgine qbtenue, vecjreur le contenant,
organismes transforms obtenus et procSdS de pr§paration w

3 DEMANDEUR (S) n» siren . . . •_ _^ . -

Nom et prenoms (souligner le nom patronymique) ou denomination

RHONE-POULENC AGRO

code APE-NAF

Forme juridique

S.A.

National^ (s) f rangaise

Adresse (s) complete (s)

•14-20 rue Pierre Baizet
69009 LYON, France

Pays

En cas (TinsurRsance de place, poursuivre sur papier litre | |

4 INVENTEUR (S) Les inventeurs sont les demandeurs

| | oui [jg non Si la reponse est non. fournir une designation separee

5 REDUCTION DU TAUX DES REDEVANCES

pi requise pour la lere fois Q requise anterieurement au depot : joindre copie de la decision d'admission

6 DECLARATION DE PRIORfTt OU REQUITE DU BENEFICE DE LA DATE DE DfePOT LVUNE DEMANDE ANTT£RIEURE
pays (forigine numero date dedeptt

nature de la demande

7 DIVISIONS anterieures a la presente demande n°

date

8 Signature du demandeur ou du mandataire

(norrret qualit*t!D>3ffifcatain) - n° d'inscription)

Franck TETAZ

SIGNATURE APRES ENREGISTREMENT DE LA DEMANDE A L'INPI

DOCUMENT COMPORTANT DES MODIFICATIONS

PAGE(S) DE LA DESCRIPTION OU DES REVENDICATIONS
OU PLANCHE(S) DE DESSIN

R-M*

DATE
DE LA
CORRESPONDANCE

TAMPON DATEUR
DU

CORRECTEUR ^

Modifies)

Suppritnee(s)

Ajoutee(s)

1 1 AOUT 1338 - S R

Un changement apporte a la redaction des revendications d'origine, sauf si ce!uk:i decoule des dispositions de I'article R.612-36 §
du code de la Propriete Intellectuelle, est signale par ta mention «R.M.» (revendications modifies). 5

Gene codant pour Fheliomicine, proteine obtenue, vecteur le contenant, organismes
transformes obtenus et precede de preparation

La presente invention a pour objet un nouveau peptide riche en cysteines appele
heliomicine, son utilisation a titre de medicament et les compositions le comprenant, une
sequence d'ADN codant pour ce peptide, un vecteur la contenant pour la transformation
d'un organisme hote et le procede de transformation dudit organisme.

L'invention conceme plus particulierement la transformation des cellules vegetales
et des-plantes, l'teliomicine produite par les plantes transformees leur conferant -une -
resistance aux maladies, en particulier d'origine fongique.

II existe aujourd'hui un besoin grandissant de rendre les plantes resistantes contre
les maladies notamment fongiques afin de diminuer, voire d'eviter, d'avoir recours a des
traitements avec des produits de protection antifongiques, en vue de proteger
l'environnement. Un moyen d'augmenter cette resistance aux maladies consiste a
transformer les plantes de maniere qu'elles produisent des substances a meme d'assurer
leur defense contre ces maladies.

Dans le domaine de la sante humaine, il existe des infections fongiques
opportunistes pour lesquelles aucun traitement reellement efficace n'est disponible a
Theure actuelle. En particulier, e'est le cas de certaines mycoses invasives graves qui
touchent des patients hospitalises dont le systeme immunitaire est deprime a la suite d'une
transplantation, d'une chimiotherapie ou de l'infection par le VIH. En comparaison de
Tarsenal des agents antibacteriens, la panoplie actuelle des agents antifongiques est tres
limitee. II existe done un besoin reel de caracteriser et de developper de nouvelles classes
de substances antifongiques.

On connait difKrentes substances d'origine naturelle, en particulier des peptides,
presentant des proprietes bactericides ou fongicides, notamment contre les champignons
responsables des maladies des plantes. Toutefois, un premier probleme consiste a trouver
de telles substances qui pourront non seulement etre produites par des plantes
transformees, mais encore conserver leurs proprietes bactericides ou fongicides et les
conferer aux dites plantes. Au sens de la presente invention, on entend par bactericide ou
fongicide tant les proprietes bactericides ou fongicides proprement dites que les proprietes

bacteriostatiques ou fongistatiques.

On connait egalement des peptides riches en cysteines presentant des activites
bactericides ou bacteriostatiques, mais qui ne presentent pas d'activite fongicide ou
fongistatique. Un autre probleme consiste a trouver un peptide riche en cysteines
5 presentant une forte activity fongicide ou fongistatique par rapport aux peptides de Fetat
de la technique.

L'heliomicine est un peptide isole a partir de Fhemolymphe du lepidoptere
Heliothis virescens qui pr&ente une activity fongicide contre les champignons
responsables des maladies des plantes et les champignons de la pathologie humaine et

10 animale. Apres avoir d'abord synthetise ie gene de Fheliomicine, on a egalement trouve
qu'il pouvait etre insere dans un organisme hote, comme une levure ou une plante, -pour
exprimer Fheliomicine et soit produire de Fheliomicine purifiee ou non, soit conferer au
dit organisme h6te des propriety de resistance aux maladies fongiques, apportant une
solution particulierement avantageuse aux problemes enonces ci-dessus.

15 L'invention a done d'abord pour objet Fheliomicine, son utilisation a titre de

medicament ou en agrochimie pour la protection des plantes, les compositions le
comprenant, un fragment d'acide nucleique codant pour Theliomicine, un gene chimere
comprenant ledit fragment codant pour Fheliomicine ainsi que des elements de regulation
en position 5' et 3 f heterologues pouvant fonctionner dans un organisme hote, en

20 particulier dans les levures ou les plantes et un vecteur pour la transformation des
organismes hotes contenant ce gene chimere, et Torganisme hote transforme. Elle
concerne aussi une cellule vegetale transformee contenant au moins un fragment d'acide
nucleique codant pour Fheliomicine et une plante resistante aux maladies contenant la dite
cellule, en particulier regeneree k partir de cette cellule. Elle concerne enfin un procede de

25 transformation des plantes pour les rendre resistantes aux maladies dans lequel on insere
un gene codant pour Fheliomicine au moyen d'un vecteur approprie. Elle concerne enfin
un procede de preparation de Fheliomicine par des organismes hotes transformes.

Par heliomicine, on entend selon Tinvention tout peptide comprenant
essentiellement la sequence peptidique de formule (I) ci-dessous,

Xaa-Cys-Xab-Cys-Xac-Cys-Xad-Cys-Xae-Cys-Xaf-Cys-Xag

(I)

dans laquelle:

Xaa est -NH2 ou un reste peptidique comprenant de 1 a 10 acides amines, de
preference de 1 a 6 acides amines,

Xab est un reste peptidique comprenant de 1 a 10 acides amine, de preference 10,
Xac est un reste peptidique comprenant 3 acides amines,

Xae est un reste peptidique comprenant de 1 a 7 acides amines, de preference 7,
Xaf est un reste peptidique de 1 acide amine, et

Xag est -OH ou un reste peptidique comprenant de 1 k 5 acides amines, de
preference 1 ou 2 acides amines.

Xaa represente la sequence peptidique suivante Xaa'-Gly-Xaa"- dans laquelle Xaa*
represente NH2 ou un reste peptidique comprenant 1 a 9 acides amines, de preference 1 a
5 acides amines, et Xaa' 'represente un reste peptidique comprenant au moins un acide
amine, choisi de preference parmi Leu, He, Val, Pro, Ser ou Thr, et/ou
15 Xab represente la sequence peptidique suivante -Val-Xab'-Asp-, dans laquelle Xab'
represente un reste peptidique comprenant de 0 a 8 acides amines, de preference 8, et/ou
Xac represente la sequence peptidique suivante -Asn-Xac'-Glu-, dans laquelle Xac'
represente un reste peptidique comprenant un acide amine, et/ou

Xad represente la sequence peptidique suivante -Lys-Xad'-Gly-His-, dans laquelle Xad'
20 represente un reste peptidique comprenant de 0 a 6 acides amines, de preference 6, et/ou
Xae represente la sequence peptidique suivante -Gly-Xae'-Asn-, dans laquelle Xae'
represente un reste peptidique comprenant de 0 a 5 acides amines, de preference 5, et/ou
Xaf represente mi des acides amines suivant -Trp-, Phe, Leu, He ou Val et/ou
Xag represente la sequence peptidique suivante -Glu-Xag' dans laquelle Xag' represente
25 OH ou un reste variable de sequence comprenant de 1 a 4 acides amines, de preference 1
acide amine.

Selon un mode de realisation preferentiel de 1' invention, Xaa ou Xaa' comprennent
au moins un acide amine basique, et/ou Xad ou Xad' comprennent au moins un acide
amine basique. De maniere avantageuse, Xad ou Xad'comprennent 1, 2, 3 ou 4 acides
30 amines basiques.

Par acides amines basiques, on entend plus particulierement selon 1' invention les
acides amines choisis parmi la lysine, Parginine ou rhomoarginine.

Selon un mode de realisation plus preferentiel de Tinvention, Xaa represente la

Xad est un reste peptidique comprenant de 1 a 9 acides amines, de preference 9,

De maniere avantageuse,

sequence peptidique suivante NH2-Asp-Lys-Leu-Ile-Gly-Ser-, et/ou Xab represente la
sequence peptidique suivante -Val-Trp-Gly-Ala-Val-Asn-Tyr-Thr-Ser-Asp-, et/ou Xac
represente la sequence peptidique suivante -Asn-Gly-Glu-, et/ou Xad represente la
sequence peptidique suivante -Lys-Arg-Arg-Gly-Tyr-:Lys-Gly-Gly-His-, et/ou Xae
represente la sequence peptidique suivante -Gly-Ser-Phe-Ala-Asn-Val-Asn-, et/ou Xaf
represente l'acide amine suivant -Trp-, et/ou Xag represente la sequence peptidique
suivante -Glu-Thr-OH.

Selon un mode de realisation plus preferentiel de 1' invention, l'heliomicine est le
peptide represents avec sa sequence codante par ridentificateur de sequence n° 2 (SEQ ID
No 2). La meme sequence est decrite, correspondant aux acides amines 6 a 49 de
Ridentificateur de sequence^ 0 1 (SEQ ID No 1) avec une sequence codante differente.-

Le r&idu NIC terminal peut presenter une modification post-traductionnelle, par
exemple une acetylation, de meme que le residu C-terminal peut presenter une
modification post-traductionnelle, par exemple une amidation.

Par sequence peptidique comprenant essentiellement la sequence peptidique de
formule generate (I), on entend non seulement les sequences deTinies ci-dessus, mais
egalement de telles sequences comprenant a Tune ou l'autre de leurs extremites, ou les
deux, des residus peptidiques necessaires a leur expression et ciblage dans un organisme
hote. Par organisme h6te on entend tout organisme comprenand au moins une cellule, qu'il
s'agisse de microorganismes, en particulier une levure ou une bacterie, ou encore de
cellules vegetates ou encore d'organismes superieurs comme les plantes.

II s'agit en particulier d'un peptide de fusion « peptide-heliomicine », dont la
coupure par les systemes enzymatiques de rorganisme h6te permet la liberation de
l'heliomicine, l'heliomicine etant definie ci-dessus. Le peptide fusionne a l'heliomicine
peut etre un peptide signal ou un peptide de transit qui permet de controler et d'orienter la
production de l'heliomicine de maniere specifique dans une partie de 1' organisme hote,
comme par exemple le cytoplasme, la membrane cellulaire, ou dans le cas des plantes dans
un type particulier de compartiments cellulaires ou de tissus ou dans la matrice
extracellulaire.

Selon un mode de realisation, le peptide de transit peut etre un signal d'adressage
chloroplastique ou mitochondrial, lequel est ensuite clive dans les chloroplastes ou les
mitochondries.

Selon un autre mode de realisation de l'invention, le peptide signal peut etre un

signal N-terminal ou « propeptide », 6ventuellement en association avec un signal
responsable de la retention de la proteine dans le reticulum endoplasmique, ou un peptide
d'adressage vacuolaire ou « propeptide ». Le reticulum endoplasmique est le lieu ou sont
pris en charge par la « machinerie cellulaire » des operations de maturation de la proteine
5 produite, comme par exemple le clivage du peptide signal.

Les peptides de transit peuvent etre soit simples, soit doubles, et dans ce cas
eventuellement s6par6s par une sequence intermediate, c'est a dire comprenant, dans le
sens de la transcription, une sequence codant pour un peptide de transit d'un gene vegetal
codant pour une enzyme k localisation plastidiale, une partie de sequence de la partie

10 mature N-terminale d ! un gene v6g&al codant pour une enzyme & localisation plastidiale,
puis une sequence codant pour un second peptide de transit d l un gene vegetal codant pour
une enzyme a localisation plastidiale, tels que decrit dans la demande EP 0 508 909.

Comme peptide de transit utile selon Finvention, on peut citer en particulier le
peptide signal du gene PR- la du tabac decrit par Comelissen & coll., represents avec sa

15 sequence codante par Tidentificateur de sequence n° 2, en particulier lorsque I'heliomicine
est produite par des cellules vSgetales ou des plantes, ou du precurseur du facteur Mat al
lorsque rheliomicine est produite dans des levures.

Le peptide de fusion « MFal/heliomicine » avec les cinq residus du propeptide du
facteur MFal (Ser-Leu-Asp-Lys-Arg), situes en position N-terminale et sa sequence

20 codante sont partie de la presente invention, en particulier decrits par Fidentificateur de
sequence n° 1 (SEQ ID No 1), correspondants aux acides amines 1 a 49. Le peptide de
fusion « peptide signal PR- la -heliomicine » et sa sequence codante sont egalement partie
de la presente invention, en particulier decrits par l'identificateur de sequence n° 3.

Selon un mode preferentiel de realisation de l' invention, les residus cysteines du

25 peptide de formule (I) forment au moins un pont disulfure intramoleculaire, de preference
trois ponts disulfides. Selon un mode preferentiel de realisation de Tinvention les ponts
disulfides sont etablis entre les residus cysteine 1 et 4, 2 et 5 et 3 et 6.

L'h61iomicine est un peptide particulierement actif contre les champignons et les
levures, et peut etre a ce titre employe a titre preventif ou curatif pour proteger differents

30 organismes contre des agressions fongiques. La presente invention conceme done
rheliomicine a titre de medicament. Elle conceme egalement l'utilisation de I'heliomicine
pour le traitement des plantes contre des agressions fongiques, en appliquant I'heliomicine
directement sur les dites plantes.

La presente invention concerne egalement une composition cornprenant
I'heliomicine et un vehicule approprie. Le vehicule approprie a pour premiere qualite de
ne pas degrader de maniere substantielle I'heliomicine dans la composition, et de ne pas
diminuer les proprietes bactericides et fongicides de Theliomicine. Cette composition peut
Stre une composition cosmetique et dans ce cas le vehicule approprie est cosmetiquement
acceptable (adapte en outre pour une application sur la peau ou les phaneres), ou une
composition pharmaceutique pour un usage therapeutique et dans ce cas le vehicule
approprie est pharmaceutiquement acceptable approprie pour une administration de
Theliomicine par voie topique, per os ou par injection, ou encore une composition
agrochimique et dans ce cas le vehicule approprie est agrochimiquement acceptable,
approprie pour une application sur les plantes ou- a proximite ties plantes, sans les
degrader.

La presente invention concerne ggalement un fragment d'acide nucleique, en
particulier d'ADN, naturel ou synthetique, codant pour rheliomicine definie ci-dessus, y
compris pour le peptide de fusion « peptide-heliomicine » defini ci-dessus. II peut s'agir
selon Tinvention d'un fragment synthetise ou isole du lepidoptere Heliothis, ou encore un
fragment derive, adapte pour T expression de rheliomicine dans Torganisme hote ou le
peptide sera exprirne. Le fragment d'acide nucleique peut etre obtenu selon les methodes
standards d' isolation et de purification, ou encore par synthese selon les techniques
usuelles d'hybridations successives d' oligonucleotides synthetiques. Ces techniques sont
notamment decrites par Ausubel et al

Selon la presente invention, on entend par « fragment d'acide nucleique » une
sequence nucteotidique pouvant etre de type ADN ou ARN, de preference de type ADN,
notamment double brin.

Selon un mode de realisation de Tinvention, le fragment d'acide nucleique codant
pour I'heliomicine comprend la sequence d'ADN decrite par les bases 16 a 147 de
l'identificateur de sequence n° 1 (SEQ ID NO 1), ou par l'identificateur de sequence n° 2
(SEQ ID NO 2), en particulier la partie codante de cette sequence correspondant aux bases
1 a 132, une sequence homologue ou une sequence complementaire de ladite sequence.

Selon un autre mode de realisation de Tinvention, le fragment d'acide nucleique
codant pour le peptide de fusion « peptide-heliomicine » comprend la sequence d'ADN
d6crite par Tidentificateur de sequence n°l (SEQ ID NO 1) ou celle decrite par
Tidentificateur de sequence n° 3 (SEQ ID NO 3), en particulier la partie codante

correspondant aux bases 3 a 224, une sequence homologue ou une sequence
complementaire des dites sequences.

Par « homologue », on entend selon l'invention un fragment d'acide nucleique
presentant une ou plusieurs modifications de sequence par rapport a la sequence
5 nucleotidique decrite par les identificateurs de sequences n° 1, 2 ou 3 et codant pour
1'heliomicine ou le peptide de fusion « peptide-h61iomicine ». Ces modifications peuvent
etre obtenues selon les techniques usuelles de mutation, ou encore en choisissant les
oligonucleotides synthetiques employes dans la preparation de ladite sequence par
hybridation. Au regard des multiples combinaisons d'acides nucleiques pouvant conduire

10 k l'expression d'un meme acide amine, les differences entre la sequence de reference
decrite par les identificateurs de sequences- n° -1,-2 -ou 3 et 1'homologue correspondant
peuvent etre importantes, d'autant plus qu'il s'agit de fragments d'ADN de faible taille
realisables par synthese chimique. De maniere avantageuse, le degre d'homologie sera
d'au moins 70 % par rapport a la sequence de reference, de preference d'au moins 80 %,

15 plus preferentiellement d'au moins 90 %. Ces modifications sont generalement neutres,
c'est a dire qu'elles n'affectent pas la sequence primaire de Theliomicine ou du peptide de
fusion resultants.

La presente invention concerne egalement un gene chim&re (ou cassette
d' expression) comprenant une sequence codante ainsi que des elements de regulation en

20 position 5 1 et 3 1 heterologues pouvant fonctionner dans un organisme hote, en particulier
les cellules vegetales ou les plantes, la sequence codante comprenant au moins un
fragment d'ADN codant pour Theliomicine ou le peptide de fusion « peptide-heliomicine »
tel que definis ci-dessus.

Par organisme hote, on entend tout organisme mono ou pluricellulaire, inferieur ou

25 superieur, dans lequel le gene chimere selon l'invention peut etre introduit, pour la
production d'heliomicine. II s'agit en particulier de bacteries, par exemple E. co/z, de
levures, en particulier des genres Saccharomyces ou Kluyveromyces, Pichia y de
champignons, en particulier Aspergillus, d'un baculovirus, ou de preference des cellules
vegetales et des plantes.

30 Par "cellule vegetale", on entend selon l'invention toute cellule issue d'une plante

et pouvant constituer des tissus indifferencies tels que des cals, des tissus differencies tels
que des embryons, des parties de plantes, des plantes ou des semences.

On entend par "plante" selon l'invention, tout organisme multicellulaire differencie

capable de photosynthese, en particulier monocotyledones ou dicotyledones, plus
particulierement des plantes de. culture destinees ou non a l'alimentation animale ou
humaine, comme le mais, le ble, le colza, le soja, le riz, la canne a sucre, la betterave, le
tabac, le coton, etc.

5 Les elements de regulation necessaires a l'expression du fragment d'ADN codant

pour l'heliomicine sont bien connus de l'homme du m6tier en fonction de l'organisme
note, lis comprennent notamment des sequences promotrices, des activateurs de
transcription, des sequences terminatrices, y compris des codons start et stop. Les moyens
et methodes pour identifier et selectionner les elements de regulation sont bien connus de

1 0 l'homme du metier.

Pour la transformation des microorganismes comme les levures ou les bacteries, les

elements de regulation sont bien connus de l'homme du metier, et comprennent

notamment des sequences promotrices, des activateurs de trancription, des peptides de

transit, des sequences terminatrices et des codons start et stop.
15 Pour diriger l'expression et la secretion du peptide dans le milieu de culture de la

levure, un fragment d'ADN codant l'heliomycine est intfgre dans un vecteur navette qui

comprend les elements suivants :

- des marqueurs permettant de selectionner les transformants. De preference, on utilise le
gene ura-3 pour la levure et le gene qui confere la resistance a l'ampicilline pour E. coli,

20 - une sequence nucleique permettant la replication (origine de replication) du plasmide
dans la levure. De preference on utilise l'origine de replication du plasmide 2u de levure,

- une sequence nucleique permettant la replication (origine de replication) du plasmide
dans E. coli,

- une cassette d' expression constitute

25 (1) d'une sequence de regulation promotrice. On peut utiliser toute

sequence promotrice d'un gene s'exprimant naturellement dans la levure. De preference,
on utilise le promoteur du gene Mfal de S. cerevisiae.

(2) d'une sequence codant pour un peptide signal (ou propeptide) en
association avec un peptide d'adressage (ou propeptide). Ces regions sont importantes

30 pour la secretion correcte du peptide. De preference, on utilise la sequence codant le pre-
pro-peptide du precurseur du facteur Mfal.

(3) d'une sequence de regulation terminatrice ou de polyadenylation. De
preference, on utilise le terminateur de la phosphoglycerate kinase (PGK) de S. cerevisiae.

Dans la cassette d' expression, la sequence codant l'heliomycine est inseree en aval de la
sequence pre-pro et en amont du terminateur de la PGK.

Ces elements ont ete decrits dans plusieurs publications dont Reichhart et ah, 1992,
Invert. Reprod. Dev., 21, pp 15-24 et Michaut et al y 1996, FEBS Letters, 395, pp 6-10 .
5 De maniere preferentielle, on transforme des levures de Tespece S. cerevisiae avec

le piasmide d' expression par la methode a T acetate de lithium (Ito et al., 1993, J.
Bacteriol, 153, pp 163-168). Les levures transformees sont selectionnees sur un milieu
g&ose selectif qui ne contient pas d'uracile. La production en masse des levures
transformees est r£alis£e par culture pendant 24h k 48 h dans un milieu liquide selectif.

10 La transformation de microorganismes permet de produire de rheliomicine a plus

large Schelle. La pr^sente invention concerne done egalement un procede de preparation
de rhSliomicine, comprenant les etapes de culture d'un micro organisme transforme
comprenant un gene codant pour rheliomicine tel que defini ci-dessus dans un milieu de
culture approprie, puis r extraction et la purification totale ou partielle de rheliomicine

15 obtenue.

De maniere preferee, lors de Fextraction de rheliomicine produite par les levures,
on elimine les levures par centrifugation et on met en contact le surnageant de culture avec
une solution acide qui peut etre une solution d'un acide mineral ou organique comme par
exemple Tacide chlorhydrique ou de l'acide acetique. L'extrait obtenu est ensuite

20 centrifuge k froid a une vitesse de 4000 a 10.000 rpm a 4°C, pendant 30 a 60 min.

La purification de rheliomicine peut etre precedee d'une etape de fractionnement
du surnageant obtenu suite a 1'etape d'extraction. De maniere preferee, au cours de l'etape
de fractionnement, l'extrait est depose sur de la phase inverse pour realiser une extraction
en phase solide. Le lavage des molecules solubles dans 1'eau est effectue avec une solution

25 acide diluee et Telution des molecules hydrophobes avec un eluant approprie. On obtient
de bons resultats avec de Tacide trifluoroacetique pour le lavage et un eluant contenant des
quantites croissantes d'acetonitrile en solution acide diluee.

De maniere preferee la purification de rheliomicine est effectuee en deux temps :
une HPLC en echange de cations suivie d'une HPLC en phase inverse avec un eluant

30 convenable qui peut etre different ou identique k celui de la phase precedente. Les
differentes etapes de la purification sont suivies par un test d' inhibition de croissance
fongique en milieu liquide. De preference, le test est effectue avec le champignon
Neurospora crass a.

La sequence de rheliomicine produite par les levures transformees est analysee
selon la methode de sequengage par degradation d'Edman et par spectrometrie de masse.
La caracterisation structurale est realisee directernent sur le peptide produit, sur le peptide
modifie par reduction/alkylation ainsi que sur des fragments du peptide. La sequence
peptidique et la masse moleculaire de rheliomicine produite ont ete comparees avec celles
de rheliomicine native extraite de rhemolymphe d'K virescens. Les resultats montrent
que les deux molecules presentent la meme structure primaire. La determination de la
position des ponts disulfure indique que Tarrangement des ponts disulfides est identique
dans les deux peptides, natif et produit par le microorganisme transforme.

L'invention conceme plus particulierement la transformation des plantes. Comme
sequence de regulation promotriee dans les plantes, on- peut- utiliser toute sequence
promotrice d'un gene s'exprimant naturellement dans les plantes en particulier un
promoteur d'origine bacterienne, virale ou v£getale tel que, par exemple, celui d'un gene de
la petite sous-unite de ribulose-biscarboxylase/oxygenase (RuBisCO) ou d'un gene de
virus de plante tel que, par exemple, celui de la mosaique du choux fleur (CAMV 19S ou
35S), ou un promoteur inductible par les pathogenes comme le PR-la du tabac, tout
promoteur convenable connu pouvant etre utilise. De preference on a recours a une
sequence de regulation promotrice qui favorise la surexpression de la sequence codante de
maniere constitutive ou induite par l'attaque d'un pathogene, tel que par exemple, celle
comprenant au mo ins un promoteur d'histone tel que decrit dans la demande EP 0 507 698.

Selon Tinvention, on peut <§galement utiliser, en association avec la sequence de
regulation promotrice, d'autres sequences de regulation, qui sont situees entre le promoteur
et la sequence codante, telles que des activateurs de transcription ("enhancer"), comme par
exemple Tactivateur de translation du virus de la mosaique du tabac (TMV) decrit dans la
demande WO 87/07644, ou du virus etch du tabac (TEV) decrit par Carrington & Freed.

Comme sequence de regulation terminatrice ou de polyadenylation, on peut utiliser
toute sequence correspondante d'origine bacterienne, comme par exemple le terminateur
nos d'Agrobacterium tumefaciens, ou encore d'origine vegetale, comme par exemple un
terminateur d'histone tel que decrit dans la demande EP 0 633 317.

Selon la presente invention, le gene chimere peut egalement etre associe a un
marqueur de selection adapte a Torganisme hote transforme. De tels mafqueurs de
selection sont bien connus de Thomme du metier. II pourra s'agir d'un gene de resistance
aux antibiotiques, ou encore un gene de tolerance aux herbicides pour les plantes.

La presente invention conceme 6galement un vecteur de clonage ou d* expression
pour la transformation d'un organisme hote contenant au moins un gene chimere tel que
defini ci-dessus. Ce vecteur comprend outre le gene chimere ci-dessus, au moins une
origine de replication. Ce vecteur peut etre constitu6 par un plasmide, un cosmide, un

5 bacteriophage ou un virus, transform^ par 1'introduction du gene chimere selon
Pinvention. De tels vecteurs de transformation en fonction de Torganisme hote a
transformer sont bien connus de Phomme du metier et largement decrits dans la litterature.

Pour la transformation des cellules vegetales ou des plantes, il s'agira notamment
d'un virus qui peut etre employe pour la transformation des plantes developpees et

10 contenant en outre ses propres elements de replication et d' expression. De maniere
preffrentielle, le vecteur de transformation des cellules vegetales- ou des -plantes selon
Tinvention est un plasmide.

L/invention a encore pour objet un precede de transformation des organismes
hotes, en particulier des cellules vegetales par integration d'au moins un fragment d'acide

15 nucleique ou un gene chimere tels que definis ci-dessus, transformation qui peut etre
obtenue par tout moyen connu approprie, amplement decrit dans la litterature specialisee
et notamment les references citees dans la presente demande, plus particulierement par le
vecteur selon 1 ' invention.

Une serie de methodes consiste a bombarder des cellules, des protoplastes ou des

20 tissus avec des particules auxquelles sont accrochees les sequences d'ADN. Une autre serie
de methodes consiste a utiliser comme moyen de transfert dans la plante un gene chimere
insere dans un plasmide Ti d'Agrobacterium tumefaciens ou Ri d'Agrobacterium
rhizogenes.

D'autres methodes peuvent etre utilises telles que la micro-injection ou
25 Telectroporation, ou encore la precipitation directe au moyen de PEG.

L'homme du metier fera le choix de la methode appropriee en fonction de la nature
de Torganisme hote, en particulier de la cellule vegetale ou de la plante.

La presente invention a encore pour objet les organismes hotes, en particulier
cellules vegetales ou plantes, transformes et contenant une quantite efificace d'un gene
30 chimere comprenant une sequence codante pour Theliomicine definie ci-dessus.

La presente invention a encore pour objet les plantes contenant des cellules
transformees, en particulier les plantes reg£nerees a partir des cellules transformees. La
regeneration est obtenue par tout procede approprie qui depende de la nature de Tespece,

comme par exemple decrit dans les references ci-dessus.

Pour les precedes de transformation des cellules vegetales et de regeneration des
plantes, on citera notamrnent les brevets et demandes de brevet suivants: US 4,459,355,
US 4,536,475, US 5,464,763, US 5,177,010, US 5,187,073, EP 267,159, EP 604 662, EP
672 752, US 4,945,050, US 5,036,006, US 5,100,792, US 5,371,014, US 5,478,744, US
5,179,022, US 5,565,346, US 5,484,956, US 5,508,468, US 5,538,877, US 5,554,798, US
5,489,520, US 5,510,318, US 5,204,253, US 5,405,765, EP 442 174, EP 486 233, EP 486
234, EP 539 563, EP 674 725, WO 91/02071 et WO 95/06128.

La presente invention concerne egalement les plantes transformees issues de la
culture et/ou du croisement des plantes regenerees ci-dessus, ainsi que les graines de
plantes transformees." - - - - - - -

Les plantes ainsi transformees sont resistantes a certaines maladies, en particulier a
certaines maladies fongiques ou bacteriennes. De ce fait, la sequence d'ADN codant pour
rhSliomicine peut etre integree avec pour objectif principal la realisation de plantes
resistantes aux dites maladies, Pheliomicine etant efficace contre des maladies fongiques
telles que celles causees par Cercospora, en particulier Cercospora beticola,
Cladosporium en particulier Cladosporium herbarum, Fusarium, en particulier Fusarium
culmorum ou Fusarium graminearum, ou par Phytophthora, en particulier Phytophtora
cinnamomu

Le gene chimere pourra comprendre egalement et de maniere avantageuse au
moins un marqueur de selection, tel qu'un ou plusieurs genes de tolerance aux herbicides.

La sequence d'ADN codant pour Theliomicine peut egalement etre integree comme
marqueur de selection lors de la transformation de plantes avec d'autres sequences codant
pour d'autres peptides ou prolines d'interet, comme par exemple des genes de tolerance
aux herbicides.

De tels genes de tolerance aux herbicides sont bien connus de Thomme du metier et
notamrnent decrits dans les demandes de brevet EP 115 673, WO 87/04181, EP 337 899,
WO 96/38567 ou WO 97/04103.

Bien entendu, les cellules et plantes transformees selon 1'invention peuvent
comprendre outre la sequence codant pour Theliomicine, d'autres sequences heterologues
codant pour des proteines d'interet comme d'autres peptides complementaires susceptibles
de conferer a la plante des resistances k dautres maladies d'origine bact^rienne ou
fongique, et/ou d'autres sequences codant pour des proteines de tolerance aux herbicides

et/ou d'autres sequences codant pour des proteines de resistance aux insectes, comme les
proteines Bt notamment.

Les autres sequences peuvent etre integrees au moyen du meme vecteur
comprenant un gene chimere, lequel comprend une premiere sequence codant pour
5 rheliomicine et au moins une autre sequence codant pour un autre peptide ou proteine
d'int&et.

Elles peuvent egalement etre integrees au moyen d'un autre vecteur comprenant au
moins la dite autre sequence, selon les techniques usuelles definies ci-dessus.

Les plantes selon invention peuvent encore etre obtenues par croisement de
10 parents, Tun portant le gene selon 1'invention codant pour rheliomicine, Tautre portant un
g6ne codant pour au moins un autre peptide ou proline d'int&dt. - - -

Parmi les sequences codant pour d'autres peptides antifongiques, on peut citer celle
codant pour la drosomycine, decrite dans la demande de brevet FR 2 725 992 et par
Fehlbaum & coll. (1994), et dans la demande de brevet non publiee FR 97 091 15 deposee
15 le 24 juillet 1997, ou celle codant pour 1'androctonine decrite dans la demande de brevet
FR 2 745 004 et dans la demande de brevet non publiee FR 97 10362 deposee le 20 aout
1997.

La presente invention conceme enfin un procdde de culture des plantes

transformees selon 1'invention, le procede consistant a planter les graines des dites plantes
20 transformees dans une surface d'un champ approprie pour la culture des dites plantes, a

appliquer sur la dite surface du dit champ une composition agrochimique, sans affecter de

maniere substantielle les dites graines ou les dites plantes transformees, puis a recolter les

plantes cultivees lorsqu'elles arrivent a la maturite souhaitee et eventuellement a separer

les graines des plantes recoltees.
25 Par composition agrochimique, on entend selon Tinvention toute composition

agrochimique comprenant au moins un produit actif ayant Tune des activites suivantes,

herbicide, fongicide, bactericide, virucide ou insecticide.

Selon un mode preferentiel de realisation du precede de culture selon T invention,

la composition agrochimique comprend au moins un produit actif ayant au moins une
30 activite fongicide et/ou bactericide, plus preferentiellement presentant une activite

complementaire de celle de rheliomicine produite par les plantes transformees selon

Tinvention.

Par produit presentant une activite complementaire de celle de rheliomicine, on

entend selon Finvention un produit presentant un spectre d'activite complementaire, c'est
a dire; un produit qui sera actif contre des attaques de contaminants (champignons,
bacteries ou virus) insensibles a rheliomicine, ou encore un produit dont le spectre
d'activite recouvre celui de rheliomicine, totalement ou en partie, et dont la dose
5 d'application sera diminuee de maniere substantielle du fait de la presence de
rheliomicine produite par la plante transformee.

Les exemples ci-apres permettent d'illustrer la presente invention, sans toutefois en
limiter la port£e.

10 Exemple I : Isolement et caracterisation de rheliomicine a partir de l'hemolymphe
prelevee chez des larves immunises du lepidoptere H. virescens
Exemple 1.1 : Isolement

1-1 Induction de la synthase biologique d'une substance antifongique dans
l'hemolymphe d' H. virescens

15 Les larves matures de Seme stade du lepidoptere H. virescens ont ete immunisees a

l'aide d'une aiguille (30 ga) prealablement plongee dans un culot de bacteries a Gram
positif (M luteus) et a Gram negatif (£1 coli 1 106) prepare a partir de cultures realisees en
milieu de Luria-Bertani durant 12 heures a 37°C. Les animaux ainsi infectes ont ete
conserves individuellement dans des tubes contenant un milieu nutritif a base d'agar

20 pendant 24 heures entre 20°C et 23°C. Avant le prelevement de Themolymphe les larves
ont ete refroidies sur de la glace.
1-2 Preparation du plasma

L'hemolymphe (environ 30 |al par larve) a ete collectee par excision d'un
appendice abdominal et recueillie dans des tubes de microcentrifugation en polypropylene

25 de 1,5 ml refroidis dans de la glace et contenant de Taprotinine comme inhibiteur de
proteases (20|ig/ml en concentration finale) et de la phenylthiouree comme inhibiteur de la
melanisation (concentration finale de 20jaM). L'hemolymphe (2 ml) ainsi collectee a partir
des larves immunisees a ete centrifugde a 14000 g pendant 1 min a 4 °C afin de retirer les
hemocytes. L'hemolymphe depoiirvue des cellules sanguines a ete conservee a -20°C

30 jusqu'a son utilisation.

1-3 Acidification du plasma

Apres decongelation rapide, le plasma d' H. virescens a ete acidifie jusqu'a pH 3
avec une solution d'acide trifluoroacetique a 1%. L'extraction en condition acide du

peptide a tte realised pendant 30 min sous agitation ltgere dans un bain d'eau glacee.
L'extrait obtenu a ete ensuite centrifuge a 4°C pendant 30 min a 10 OOOg.
1-4 Purification des peptides

a) Prepurification par extraction en phase solide

Une quantite d'extrait equivalente a 2ml d'hemolymphe a ete deposde sur un
support de phase inyerse, tel que commercialism sous la forme de cartouche (Sep-Pak™
CI 8, Waters Associates), equilibrt avec de l'eau acidifite (TFA 0,05 %). Les molecules
hydrophiles ont ett tliminees par un simple lavage avec de l'eau acidifiee. L'elution du
peptide a ett realisee par une solution d'acetonitrile a 40% preparee dans le TFA 0,05%.
La fraction eluee a 40% d'acetonitrile a ett sechee sous vide dans le but d'eliminer
Tacetonitrile et le TFA puis elle a ett reconstitute tlans de l'eau ultrapure sterile avant -
d'etre soumise a la premiere etape de purification.

b) Purification par chromatographic liquide a haute performance (HPLC) sur
colonne de phase inverse.

-premiere etape : la fraction contenant le peptide a ttt analysed par
chromatographic de phase inverse sur une colonne semi-preparative Aquapore RP-3Q0 C 8
(Brownlee™, 220 x 70 mm, 300 A ), l'tlution a ete realisee par un gradient lineaire
d'acttonitrile de 2 a 60% dans le TFA 0,05% pendant 120 minutes a un dtbit constant de
l,5ml/min. Les fractions ont ttt collecttes manuellement en suivant la variation de
l'absorbance a 225 nm et 254 nm. Les fractions recueillies ont ttt asstchtes sous vide,
reconstitutes avec de l'eau ultrapure et analysees pour leur activitt antifongique en
utilisant le test decrit ci-dessous.

- deuxieme Stapc : la fraction antifongique correspondant au peptide a 6t6 analysee sur
une colonne analytique de phase inverse Aquapore RP-300 C 8 (Brownlee™, 220 x 4,6
mm, 300 A), en utilisant un gradient lineaire diphasique d'acetonitrile de 2% a 22% en 10
min et de 22 a 32% en 50 min dans le TFA 0,05% avec un dtbit constant de 0,8 ml/min.
Les fractions ont 6t6 collectees manuellement en suivant la variation de l'absorbance a 225
nm et 254 nm. Les fractions recueillies ont ete assechees sous vide, reconstitutes avec de
l'eau ultrapure et analysees pour leur activity antifongique dans les conditions decrites ci-
dessous.

- troisieme ttape : la fraction antifongique contenant le peptide a 6t6 purifiee jusqu'a
homogtntite" sur une colonne de phase inverse Narrowbore Delta-Pak™ HPIC 18 (Waters
Associates, 150 x 2,2 mm) eu utilisant un gradient lintaire diphasique d'acetonitrile de 2%

a 24% en 10 min et de 24 k 44% en 100 min dans le TFA 0,05% avec un debit constant de
0,25 ml/ min a une temperature controlee de 30°C. Les fractions ont ete collectees
manuellement en suivant la variation de I'absorbance a 225 nm. Les fractions recueillies
ont ete assechees sons vide, reconstitutes avec de l'eau ultrapure filtree et analysees pour
5 leur activite antifongique.

Exemple 1.2 : caracterisation structurale du peptide

2-1 Verification de la purete par electrophorese capillaire de zone

La purete du peptide antifongique a ete verifiee par electrophorese capillaire de
zone sur un modele 270-HT (^Applied Biosystems division de Perkin Elmer), lnl d'une
10 solution a SO^M de peptide purifie a ete injecte sous assistance par le vide dans un
capillaire de silice (72 cm x 50 \im) et Tanalyse a eterealisee en tampon citrate 20 mM a
pH 2,5. L'electrophorese a ete realisee h 20 kV de 1'anode a la cathode pendant 20 min a 4^
30°C. La migration a et£ enregistree a 200 nm.

2-2 Determination du nombre des cysteines : reduction et S-pyridylethylation.

15 Le nombre de residus cysteine a ete determine sur le peptide natif par reduction et

S-pyridylethylation. 100 pmoles de peptide natif ont ete reduites dans 40 jil de tampon
Tris/HCl 0,5 M, pH 7,5 contenant 2 mM d'EDTA et 6 M de chlorure de guanidinium en
presence de 2 |il de dithiothreitol 2,2 M. Le milieu reactionnel a ete place sous atmosphere
d'azote. Apres 60 min d'incubation a 1'obscurite, 2 |^1 de 4-vinylpyridine fraichement

20 distillee ont ete ajoutes a la reaction qui a ete alors incubee durant 10 min a 45°C a
1'obscurite et sous atmosphere d'azote. Le peptide pyridylethyle a ete ensuite separe des
constituants du milieu reactionnel par chromatographic de phase inverse en utilisant un ^
gradient lineaire d'acetonitrile en presence de TFA 0,05%.

2-3 Determination de la masse du peptide natif, du peptide S-pyridylethyle et des
25 fragments de proteolyse .par spectrometrie de masse MALDI-TOF (Matrix Assisted
Laser Desorption Ionization-Time Of Flight).

Les mesures de masses ont ete effectuees sur im spectrometre de masse MALDI-
TOF Bruker Biflex (Bremen, Allemagne) en mode lineaire positif. Les spectres de masse
ont ete calibres de fa?on externe avec un melange standard de peptides de m/z connues,
30 respectivement 2199.5 Da, 3046.4 Da et 4890.5 Da. Les differents produits a analyser ont
ete deposes sur une fine couche de cristaux d'acide a-cyano-4-hydroxycinnamique
obtenue par une evaporation rapide d'une solution saturee dans Tacetone. Apres sechage
sous un leger vide, les echantillons ont ete laves par une goutte d'acide trifluoroacetique a

• #

0,1% avant d'etre introduits dans le spectrometre de masse.
2-4 Sequencage par degradation d'Edman.

Le sequencage automatique par degradation d'Edman du peptide natif, du peptide
S-pyridylethyte et des differents fragments obtenus apres les differents clivages
proteolytiques et la detection des derives phenylthiohydantoines ont ete realises sur un
sequenceur ABI473A (/^Applied Biosystems division de Perkin Helmer).
2-5 Clivages proteolytiques.

- Confirmation de la sequence peptidique dans la region C-terminale.

200 pmoles de peptide reduit et S-pyridyl6thyle ont 6t6 incubees en presence de 5
pmoles d'endoproteinase-Lys-C (Acromobacter protease I, clivage specifique des residus
lysine du cote C-terminal, Takara, Otsu) selon les conditions preconisees par le -fournisseur-
(Tris HC1 10 mM pH 9 en presence de Tween 20 a 0,01%). Apres arret de la reaction avec
du TFA 1%, les fragments peptidiques ont ete separ6s par HPLC en phase inverse sur une
colonne de type Narrowbore Delta-Pak™ HPIC, g (Waters Associates, 150 x 2 mm) dans
un gradient lineaire d'acetonitrile de 2 a 60% en 80 min dans le TFA 0,05% avec un debit
de 0,2 ml/min et une temperature constante de 37°C. Les fragments obtenus ont ete
analyses par spectrometrie de masse MALDI-TOF et le peptide correspondant au fragment
C-terminal a ete sequence par degradation d'Edman.

-Determination de l'arrangement des ponts disulfure par proteolyse a la
thermolysine.

Le peptide natif (8 ug) a ete incube durant 1 heure en presence de 4 ug de
thermolysine (Boehringer Manheim, rapport thermolysine/peptide, 1/2 en poids : poids) a
37°C dans le tampon MES (N-ethylmorpholine) 0,1 M a pH 7 en presence de 2 mM de
CaC12. La reaction a ete arrStee par addition d'acide formique et les produits de la reaction
ont ete imm<§diatement separes par chromatographie de phase inverse sur une colonne
Narrowbore Delta-Pak™ HPIC, 8 (Waters Associates, 150 x 2,2 mm) dans un gradient
lineaire d'acetonitrile de 2 a 50% en 1 00 min dans du TFA 0,05% au debit de 0,2 ml/min a
30°C precedee d'une 6tape isocratique a 2 % d'acetonitrile pendant 10 min. Les fragments
obtenues ont ete analysds par spectrometrie de masse MALDI-TOF et sequences par
degradation d'Edman.

Exemple II ; Expression de 1'heliomicine dans la levure Saccharomyces cerevisiae.

Toutes les techniques employees ci-apres sont des techniques standards de

laboratoire. Les protocoles detailles de ces techniques ont ete notamment decrits dans
Ausubel et ah

Exemple II- 1 Assemblage du gene synthetique

L'assemblage a ete realise a partir de 6 oligonucleotides synthetiques codant pour
5 les 44 acides amines de Th^liomicine precedes des 5 acides amines C-terminaux de la
preprosequence du facteur al (Mfal) de la levure. Les oligonucleotides repr&entes sur la
figure 1 ont ete choisis en tenant compte des codons preferentiels utilises par S. cerevisiae.
L'assemblage s'est deroul6 en plusieurs etapes :

- les oligonucleotides 2 a 5 ont et6 phosphorytes a leurs extremites 5* par action de
1 0 la polynucleotide kinase (New England Biolabs) ;

- les oligonucleotides 1 a 6 ont ete melanges, chauffes a 100°C et hybrides par
diminution lente de la temperature a 25 °C pendant 3 heures ;

-les oligonucleotides hybrides ont ete soumis a xan traitement par la ligase du
bacteriophage T4 (New England Biolabs) pendant 15 heures a 15° C ;

15 - le bloc d' ADN resultant de l'hybridation des oligonucleotides represents sur la

figure 1, borne par les sites de restriction HinDIII et Bglll, a ete insere dans le plasmide
pBluescript SK+ (Stratagene) digere par les en2ymes HinDIII et BamHI (Bglll et BamHI
sont compatibles). Le melange de ligation a ensuite ete utilise pour transformer des
cellules competentes d' E. coli DH5a. (Stratagene). Plusieurs clones ont ete analyses et

20 sequences. Un de ces clones qui presentait la sequence recherche a ete appele pSEAl.

Exemple II-2 : Construction du vecteur pSEA2 qui permet la secretion de
1'heliomicine synthetisee.

Le fragment d'ADN HinDIII-Sall du vecteur pSEAl, portant la sequence codant
rheliomicine ainsi que le fragment Sphl-HinDIII du vecteur M13JM132 (Michaut et al,

25 1985, FEBS Letters, 395, pp 6-10) ont 6t€ inseres entre les sites SphI et Sail du plasmide
pTG4812 (Michaut et al, 1996, FEBS Letters, 395, pp 6-10). Le fragment Sphl-HinDIII
du vecteur M 13 JM 132 contient la sequence du promoteur du gene MFocl de la levure ainsi
que la sequence codant la region pre-pro du facteur MFotl. Dans le plasmide resultant,
pSEA2, le gene synthetique de Th^liomicine se retrouve done insere entre les sequences

30 pre-pro du facteur Mfal et le terminateur de transcription; cette construction doit done
assurer la maturation et la secretion de Theliomicine.

Exemple II-3 : Transformation d f une souche de S. cerevisiae par FADN du plasmide
pSEA2 et analyse des transformants.

La souche de levure TGY 48.1 (MATa, ura3-D5,his,pral,prbl, prcl, cpsl ;
Reichhart et al., 1992, Invert. Reprod. Dev. 21, pp 15-24) a ete transformee par le
plasmide pSEA2. Les transformants ont ete selectionnes a 29°C sur un milieu selectif
YNBG (0,67% yeast nitrogen base, 2% glucose), supplements avec 0,5 % de casamino
acides et ne contenant pas d'uracile. Apres transformation, plusieurs clones de levures,
selectionnes pour le caractere ura+, ont ete mis en culture pendant 48 h a 29°C dans 50 ml
de milieu selectif. Apres centrifugation (4000 g, 30 min, 4°C), le surnageant a ete acidifie
jusqu'a pH 3,5 avec de l'acide antique, avant d'etre depose sur une cartouche Sep-Pak™
C I8 , (Waters Associates) equilibree avec de l'eau acidifiee (TFA 0,05 %). Les differentes
proteines fixees sur la cartouche ont ete eludes par des solutions de TFA 0,05% contenant
des pourcentages croissants d'acetonitrile.

La fraction 40 %, presentant une activite antifongique, a <St6 analysee en HPLC sur
une colonne analytique de phase inverse Aquapore RP-300 Q (Brownlee™, 220 x 4,6
mm, 300 A), en utilisant un gradient lineaire d'acetonitrile de 2% a 40% en 80 min dans le
TFA 0,05% avec un debit constant de 0,8 ml/min. Les fractions ont et£ collectees
manuellement en suivant la variation de l'absorbance a 225 nm et 254 nm. Les fractions
recueillies ont ele assechees sous vide, reconstitutes avec de l'eau ultrapure et analysees
pour leur activite antifongique dans les conditions decrites dans l'exemple III. La
caracterisation structurale du peptide a 6t<§ realisee comme decrit dans l'exemple 1.2.
Exemple II-4 : Production d'heliomicine recombinante a l'echelle semi-preparative.

Un des clones de levure transformee exprimant l'heliomicine a ete cultive a 29°C
pendant 24 h dans 100 ml de milieu selectif. Cette preculture a ensuite 6t6 utilisde pour
inoculer 4 1 de milieu selectif et la culture a ete realisee pendant 48 h a 29 °C. Les levures
ont et6 eliminees par centrifugation (4000 g, 30 min, 4°C). Le surnageant a ete acidifie
jusqu'a pH 3,5 avec de l'acide antique, soumis a une deuxieme centrifugation (4000 g, 30
min, 4°C) avant d'etre depose sur une colonne ouverte de phase inverse preparative C I8
(Waters Associates), 125 A, 6 g de phase pour 500 ml de surnageant) equilibree avec de
l'eau acidifiee (TFA 0,05 %). Les molecules hydrophiles ont ete eliminees par un lavage
avec de l'eau acidifiee suivie d'un lavage avec une solution d'acetonitrile a 15% preparee
dans le TFA 0,05%. L'elution du peptide a ete realisee par une solution d'acetonitrile a
40% preparee dans le TFA 0,05%. La fraction eluee a 40% d'acetonitrile a ete lyophilisee
puis reconstituee dans de l'eau ultrapure stenle avant d'etre soumise a la premiere etape de
purification.

- premiere Stape de purification par HPLC : la fraction prepurifiee contenant
l'heliomicine a et6 reconstitute dans une solution d'acetate d'amrnonium a 25 mM, pH
3,4. Cet echantillon a ete injecte sur une colonne preparative d'echange de cations
Aquapore Cation Exchange (Brownlee™, 250 x 10 mm), en utilisant un gradient lineaire

5 de NaCl de 0% a 100% en 90 min dans 1' acetate d'amrnonium 25 mM, pH 3,4 avec un
debit constant de 2 ml/min. Les fractions recueillies ont ete assechees sous vide,
reconstitutes avec de Feau ultrapure et analysees pour leur activite antifongique dans les
conditions dtcrites ci-dessous.

- deuxieme etape de purification par HPLC : l'heliomicine a ete purifiee jusqu'a
10 homogeneite par chromatographie sur une colonne de phase inverse semi-preparative

- Aquapore RP-300 CS (Brownlee™, 220 x 7 mm, 300 A), eu utilisant un gradient- lineaire
d'acetonitrile de 2% a 40% en 80 min dans le TFA 0,05% avec un debit constant de 2 ml/
min.

15 Exemple III : Test d'activite in vitro : mesure de Pactivite antifongique par
microspectrophotometrie.

Cette methodologie a ete utilisee pour la mise en evidence des molecules
antifongiques au cours des differentes etapes de purification, pour la determination du
spectre d' activite du peptide et pour la determination de la concentration minimale

20 inhibitrice (CMI) a laquelle le peptide a ete actif. La CMI a ete exprimee comme un
intervalle de concentration [a] - [b] ou [a] a ete la concentration minimale ou Ton observe
un debut de croissance et [b] la concentration pour laquelle aucune croissance n'a ete
observee. Des exemples de Tactivite specifique de l'heliomicine, vis-a-vis des
champignons filamenteux et des levures, sont donnes dans les tableaux 1 et 2.

25 Exemple III-l : Test de detection d'activite contre les champignons filamenteux

L' activite antifongique a ete detectee par un test d' inhibition de croissance en
milieu liquide. Les spores des champignons a tester ont 6t€ mises en suspension dans un
milieu de culture de type « Pomme de terre-Glucose ». De preference, on utilise 12 g de
milieu Potato Dextrose Broth (Difco) pour 1 1 d'eau demineralis^e. Deux antibiotiques ont

30 ete rajoutes au milieu de culture : la tetracycline (concentration finale de 10 jig/ml) et la
cefotaxime (100|ig/rnl). On depose 10 jxl de chaque fraction a analyser dans des plaques de
microtitration en presence de 90 fil de milieu de culture contenant les spores (a une
concentration finale de 104 spores/ml). L' incubation a ete realisee en charnbre humide a

30°C durant 48 heures. La croissance fongique a ete observee au microscope photonique
apres 24 h et quantifiee apres 48 heures par mesure de l'absorbance a 600 nm a Paide d'un
spectrophotometre lecteur de plaque de microtitration..

- champignons filamenteux testes : Aspergillus fumigatus (don du Dr H. Koenig,
5 Hopital civil, Strasbourg) ; Nectria haematococca, Fusarium culmorum, Trichoderma
viride (mycothfeque de l'Universite Catholique de Leuven, Belgique) ; Neurospora crassa,
Fusarium oxysporum, (mycotheque de la Societe Clause, Paris).

Les r£sultats du test d'activite de rh61iomicine contre les champignons
filamenteux sont reportes dans le Tableau 1 ci-dessous.
10 Tableau 1 : activite de Theliomicine contre les champignons filamenteux

•

Champignons

CMI de l'heliomicine diM)

Neurospora crassa

0,1-0,2

Fusarium culmorum

0,2-0,4

Fusarium oxysporum

1,5-3

Nectria haematococca

0,4-0,8

Trichoderma viride

1,5-3

Aspergillus fumigatus

6-12,5

Exemple III-2 : Test de detection d' activite contre les levures

Les differentes souches de levure ont ete mises en incubation dans un milieu de
15 culture de type « Sabouraud » et incubee a 30°C pendant 24 h sous agitation lente.

L'6chantillon k tester (10 \xl) a ete depose dans des puits de plaque de microtitration dans

lesquels ont ete ajout6s 90 \il d'une culture dilute de levure dont la density a 6x6 ajustee a

DO 600 = 0,00L On evalue la croissance par la mesure de l'absorbance a 600 nm a Taide

d*un spectrophotometre lecteur de plaque de microtitration.
20 -levures testees : Candida albicans, C. glabrata, C. tropicalis, C. krusei, C.

inconspicua, Cryptococcus neoformans, Cryp. albidus, Saccharomyces cerevisiae (don du

Dr H. Koenig, Hopital civil, Strasbourg)

Les resultats du test d'activitS de Theliomicine contre les levures sont reportes dans

le Tableau 2 ci-dessous.

Tableau 2 : activite de Theliomicine contre les levures.

Levures

CMI de Pheliomicine (jiM)

Candida albicans

2,5-5

Candida tropicalis
Candida krusei

2,5-5

10-20

Candida inconspicua
Cryptococcus neoformans
Cryptococcus albidus

5-10

2,5-5

5-10

Ces resultats montrent l'excellente activity antifongique du peptide -selon
l f invention.

Exemple IV ; Preparation d'une plante transformee comprenant un gene codant
pour Pheliomicine

Cet exemple decrit la preparation de la sequence codant pour rheliomicine pour
son expression dans une cellule vegetale, du gene chimere, du vecteur d'integration et des
plantes transformees. Les figures 2 a 6 en annexe dScrivent les structures sch^matiques de
certains plasmides prepares pour la construction des genes chimeres. Dans ces figures, les
differents sites de restriction sont marques en italiques.

Toutes les techniques employees ci-apres sont des techniques standard de
laboratoire. Les protocoles detailles de ces techniques sont notamment decrits dans
Ausubel & coll.

Exemple IV-1 : Construction des genes chimeres pour la transformation de plantes
pRPA-MD-P: Creation d'un plasmide contenant le signal peptide du gene PR-la du
tabac.

Les deux oligonucleotides synthetiques complementaires Oligo 7 et Oligo 8 ci-
apres, sont hybrid6s a 65 °C pendant 5 minutes puis par diminution lente de la temperature
a 30°C pendant 30*.

Oligo 7: 5 1 GCGTCGACGC GATGGGTTTC GTGCTTTTCT CTCAGCTTCC

ATCTTTCCTT CTTGTGTCTA CTCTTCTTCT TTTCC 3 '

OligO 8: 5 ' TCGCCGGCAC GGCAAGAGTA AGAGATCACA AGGAAAAGAA

GAAGAGTAGA CACAAGAAGG AAAGATGGAA GC 3'

Apres hybridation entre l'Oligo 7 et l'Oligo 8, l'ADN reste simple brin sert de
5 matrice au fragment klenow de la polymerase 1 de E. coli (dans les conditions standard
preconisees par le fabriquant (New England Biolabs)) pour la creation de l'oligonucleotide
double brin a partir de l'extremite' 3' de chaque oligo. L'oligonucleotide double brin
obtenu est ensuite digere' par les enzymes de restriction SacII et NaeJ et clone dans le
plasmide pBS II SK(-) (Stratagene) dig<Jr<§ par les mSme enzymes de restriction. On
10 obtient alors un clone comprenant la region codant pour peptide signal du gene PR- la du
tabacj(SEQJDK0 4). ...

pRPA-PS-PRla-helio : Creation d'une sequence codant pour l'heliomicine fusionee
au signal peptide PR-la sans region non transcrite en 3*.

Les deux oligonucleotides synthetiques complementaires de sequences Oligo 9 et
1 5 Oligo 1 0 selon les conditions operatoires decrites pour pRPA-MD-P.

Oligo 9: 5' GATAAGCTTA TCGGTTCCTG CGTGTGGGGT GCTGTGAACT

ACACTTCCGA TTGCAACGGT GAGTGCAAGA GGAGGGGTTA 3 '

20 Oligo 10: 5 1 CCGGATCCGT CGACACGTTC GCCTCGCCGA GCTCTCAAGT

CTCGCACCAG CAGTTCACGT TAGCGAAGGA ACCGCAGTGA
CCACCCTTGT AACCCCTCCT CTTGCACTC 3'

Apres hybridation entre l'Oligo 9 et l'Oligo 10, l'ADN reste simple brin sert de
25 matrice au fragment klenow de la polymerase 1 de E. coli (dans les conditions standard
preconisees par le fabriquant (New England Biolabs)) pour la creation de l'oligonucleotide
double brin a partir de l'extremite 3' de chaque oligo. Cet oligonucleotide double brin
contenant la partie codante de l'heliomicine (SEQ ID NO 2) est ensuite clone" directement
dans le plasmide pRPA-MD-P qui a 6t£ digere avec 1'enzyme de restriction Nael.
30 L'orientation correcte du clone obtenu est verifiee par sequencage. On obtient alors un
clone comprenant la region codant pour la proteme de fusion PR-la-h61iomicine situee
entre les sites de restriction Ncol a l'extremite N-terminale et Seal, SacII et BamHI a
l'extremitS C-terminale (SEQ ID NO 3).

pRPA-RD-239 : Creation d'un vecteur d'expression dans les plantes comprenant la
sequence codant pour la proteine de fusion PR-la-heliomicine.

Le plasmide pRTL-2 GUS, derive du plasmide pUC-19, a ete obtenu auprSs du Dr.
Jim Carrington (Texas A&M University, non decrit). Ce plasmide dont la structure
5 sch&natique est representee sur la figure 2, contient le promoteur CaMV 35 S duplique
isole du virus de la mosaique du choux fleur (Promoteur CaMV 2x35S; Odell & coll.,
1985) qui dirige l'expression d'un ARN contenant sequence non traduite en 5' du virus etch
du tabac (TEV 5' UTR; Carrington & Freed, 1990), le gene de la p-glucuronidase d' E.
coli (GUS Jefferson & coll., 1987) suivi du site de polyadenylation de TARN 35S de

1 0 CaMV (CaMV polyA; Odell & coll., 1 985).

Le plasmide pRTL-2 GUS est dig6re avec les enzymes de restriction Ncol et
BamHI et le grand fragment d'ADN est purifie. Le plasmide pRPA-PS-PRla-helio est
digere avec les enzymes de restriction Ncol et BamHI et le petit fragment d'ADN
contenant la region codant pour la proteine de fusion PR-la-heliomicine est purifie. Les

15 deux fragments d f ADN purifies sont ensuite lies ensemble dans une cassette d'expression
dans les plantes qui synthetise une proteine de fusion PR-la-heliomicine. La structure
schematique de cette cassette d'expression est representee sur la figure 3. « PR-la-
heliomicine » represente la region codante pour la proteine de fusion PR-la-heliomicine
de pRPA-RD-239. L'heliomicine est transportee vers la matrice extra-cellulaire de la

20 plante par Taction du peptide signal PR- la.

pRPA-RD-195 ; Creation d'un plasmide contenant un site de clonage multiple
modifie.

Le plasmide pRPA-RD-195 est un plasmide derive du pUC-19 qui contient un site
de clonage multiple modifie. Les oligonucleotides synth&iques compl6mentaires Oligo 1 1
25 et Oligo 12 ci-apres, sont hybrides et rendus double brin selon la procedure decrite pour
pRPA-MD-P.

Oligo 11: 5 1 AGGGCCCCCT AGGGTTTAAA CGGCCAGTCA GGCCGAATTC
GAGCTCGGTA CCCGGGGATC CTCTAGAGTC GACCTGCAGG
30 CATGC 3 1

Oligo 12: 5 1 CCCTGAACCA GGCTCGAGGG CGCGCCTTAA TTAAAAGCTT
GCATGCCTGC AGGTCGACTC TAGAGG 3 1

^oligonucleotide double brin obtenu est ensuite lie dans pUC-19 qui a 6te
prealablement digere avec les enzymes de restriction EcoRl et Hindlll et rendu bouts
francs en employant le fragment klenow de l'ADN polymerase 1 de E. coll On obtient un
5 vecteur contenant de multiples sites de clonage pour faciliter 1'introduction des cassettes
d'expression dans un plasmide vecteur d'Agrobacterium tumefaciens. La structure
sch&natique de ce site de clonage multiple est representee sur la figure 4.
pRPA-RD-240: Introduction de la cassette d'expression de PR-la-heliomicine de
pRPA-RD-239 dans pRPA-RD-195.

10 Le plasmide pRPA-RD-239 est digere avec Tenzyme de restriction PstIL Le

fragment d'ADN contenant la cassette d'expression de PR-la-heliomicine est purifie. Le
fragment purifie est ensuite lie dans pRPA-RP-195 qui a 6te prealablement digere avec
Tenzyme de restriction Pstllet dephosphoryle avec la phosphatase intestinale de veau.
pRPA-RP-174 : Plasmide derive de pRPA-BL-150A (EP 0 508 909) contenant le gene

15 de tolerance au bromoxynil de pRPA-BL-237 (EP 0 508 909).

Le gene de tolerence au bromoxynil est isole de pRPA-BL-237 par une
amplification genique par PCR. Le fragment obtenu est k bouts francs et est clone dans le
site EcoRI de pRPA-BL-150A qui a ete rendu bouts francs par Taction de la polymerase
klenow dans des conditions standard. On obtient un vecteur & % Agrobacterium tumefaciens

20 qui contient le gene de tolerance au bromoxynil a proximite de sa bordure droite, un gene
de tolerance a la kanamycine a proximite de sa bordure gauche et un site de clonage
multiple entre ces deux genes.

La structure schematique de pRPA-RD-174 est representee sur la figure 5. Sur
cette figure, "nos" represente le site de polyadenylation de la nopaline synthase

25 flAgrobacterium tumefaciens (Bevan & coll., 1983), "NOS pro" represente le promoteur
de la nopaline synthase d'Agrobacterium tumefaciens (Bevan & coll., 1983), "NPT II"
represente le gdne de la neomycine phosphotranspherase du transposon Tn5 de E. coli
(Rothstein & coll., 1981), M 35S pro" represente le promoteur 35S isole du virus de la
mosai'que du choux fleur (Odell & coll., 1985), "BRX" represente le gene de la nitrilase

30 isole de K ozaenae (Stalker & coll., 1988), "RB" et "LB" representent respectivement les
bordures droite et gauche de la sequence d'un plasmide Ti d'Agrobacterium tumefaciens.

pRPA-RD-184 ; Addition d'un nouveau site de restriction, unique, dans pRPA-RD-
174.

Les oligonucleotides synthetiques complementaires Oligo 13 et Oligo 14 ci-apres,
sont hybrides et rendus double brin selon la procedure decrite pour pRPA-MD-P.

Oligo 13: 5' CCGGCCAGTC AGGCCACACT TAATTAAGTT TAAACGCGGC
CCCGGCGCGC CTAGGTGTGT GCTCGAGGGC CCAACCTCAG
TACCTGGTTC AGG 3'

10 Oligo 14: 5 ' CCGGCCTGAA CCAGGTACTG AGGTTGGGCC CTCGAGCACA

CACCTAGGCG CGCCGGGGCC GCGTTTAAAC TTAATTAAGT
GTGGCCTGAC TGG 3'

L'oligonucleotide double brin hybride (95 paires de bases) est purifie apres
15 separation sur un gel d'agarose (3 % Nusieve, FMC). Le plasmide pRPA-RD-174 est
digere avec l'enzyme de restriction Xmal et le grand fragment d'ADN est purifie. Les deux
fragments d' ADN obtenus sont ensuite lies.

On obtient un plasmide derive de pRPA-RD-174 comprenant d'autres sites de
restriction entre le gene de tolerance au bromoxynil et le gene de la kanamycine marqueur
20 de selection.

La structure schematique du plasmide pRPA-RD-184 est representee sur la figure 6
ou les termes "nos", "NPT II", "NOS pro", "35S pro", "BRX gene", n RB n et "LB" ont la
meme signification que pour la figure 5.

p RPA-RD-241 ; Creation d'un vecteur d'Agrobacterium tumefaciens contenant la
25 construction du gene codant pour Pheliomicine dirigee vers la matrice
extracellulaire.

La plasmide pRPA-RD-240 est digere avec les enzymes de restriction Sfill et Ascl
et le fragment d'ADN contenant le gene de PR-la-heliomicine est pxirifi^. Le plasmide
pRPA-RD-184 est diger6 avec les meme enzymes de restriction. Le fragment d'ADN
30 contenant la cassette d'expression de PR-la-heliomicine est ensuite liee dans pRPA-RD-
184. On obtient ainsi un vecteur d'Agrobacterium tumefaciens contenant la sequence
codant pour la proteine de fusion PR-la-heliomicine qui conduit a Texpression de
Theliomicine dans la matrice extracellulaire de la plante.

Exemple IV-2: Preparation de tabacs transformed.

2.1- Transformation

Le vecteurs pRPA-RD-241 est introduit dans la souche d'Agrobacterium
5 tumefaciens EHA101 (Hood & coll., 1987) porteuse du cosmide pTVK291 (Komari &
coll., 1986). La technique de transformation est bas£e sur la procedure de Horsh & coll.
(1985).

2.2- Regeneration

La regeneration du tabac PBD6 (provenance SEITA France) a partir d'explants
10 foliaires est realis6e sur un milieu de base Murashige et Skoog (MS) comprenant 30 g/1 de
saccharose ainsi que -200 ^g/ml de kanamycine. Les-explants foliaires sont preleves sur
des plantes cultivees en serre ou in vitro et r£g£n6rees selon la technique des disques
foliaires (Horsh & coll., 1985) en trois etapes successives: la premiere comprend
Tinduction des pousses sur un milieu additionne de 30 g/1 de saccharose contenant 0,05
15 mg/1 d'acide naphtylacetique (ANA) et 2 mg/1 de benzylaminopurine (BAP) pendant 15
jours. Les pousses formees au cours de cette etape sont ensuite developpees pendant 10
jours par culture sur un milieu MS additionne de 30 g/1 de saccharose mais ne contenant
pas d'hormone. Puis on preleve des pousses developpees et on les cultive sur un milieu
d'enracinement MS a teneur moitie en sels, vitamines et Sucre et ne contenant pas
20 d'hormone. Au bout d'environ 15 jours, les pousses enracinees sont passees en terre.

2.3- Tolerance au bromoxynil

Vingt plantes transformees ont ete regenerees et passees en serre pour la
construction pRPA-RD-241. Ces plantes ont ete traitees en serre au stade 5 feuilles avec
une suspension aqueuse de Pardner correspondant k 0,2 kg de matiere active bromoxynil
25 par hectare.

Toutes les plantes montrant une tolerance complete au bromoxynil sont ensuites
employees dans differentes experimentations qui montrent que Texpression de
1'heiiomicine par les plantes transformees les rend resistantes a\ix agressions fongiques.

Exemple V : Exemple de formulations comprenant de Pheliomicine

Dans tous les exemples de formulations ci-dessous, on designe par matiere active
rheliomicine definie par la formule I selon Tinvention, et plus particulierement

Fheliomicine preparee selon les exemples ci-dessus.

Exemple V-l : concentres emulsionnables

Exemple CE 1 :

5 - matiere active 400 g/1

- dodecylbenzene sulfonate alcalin 24 g/1

- nonylphenol oxy&hyle a 10 molecules

d'oxyde Methylene 1 6 g/1

- cyclohexanone 200 g/1

10 - solvant aromatique q.s.p. 1 litre

Exemple CE 2

- matiere active 250 g

- huile vegetale epoxydee 25 g
15 - melange de sulfonate d'alcoylaryle et

d'ether de polyglycol et d'alcools gras 100 g

- diAndhylformamide 50 g

- xylene 575 g

20 Exemple V-2 : suspension concentree

Exemple SC 1 :

- matiere active

500 g

- phosphate de tristyrylphenol polyethoxyle

50 g

- alkylph&iol polyethoxyl6

50 g

- polycarboxylate de sodium

20 g

- ethylene glycol

50 g

- huile organopolysiloxanique (antimousse)

- polysaccharide

1,5 g

- eau

316,5 g

Exemple V-3 : poudres mouillables (ou poudres a pulveriser) :

Exemple PM 1

- matiere active 50%

- alcool gras ethoxyle (agent mouillant) 2,5%
35 - phenytethylphenol 6thoxyl6 (agent dispersant) 5%

- craie (support inerte) 42,5%

Exemple PM 2 :
- matiere active

10%

- alcool synth6tique oxo de type ramifte, en
CI 3 ethoxyie par 8 a 10 oxyde Methylene

(agent mouillant) 0,75%

- lignosulfonate de calcium neutre (agent

5 dispersant) 12%

- carbonate de calcium (charge inerte) q s.p. 100 %

Exemnle PM 3 :

- matiere active 75%
10 - agent mouillant 1 ,50%

- agent dispersant 8%

- carbonate de calcium (charge inerte) q.s.p. 100%

Exemnle PM 4 :

1 5 - matiere active 90%

- alcool gras ethoxyie (agent mouillant) 4%

- phenylethylphenol ethoxyte (agent dispersant) 6%

50%

Exemple PM 5 :
20 - matiere active

- melange de tensio-actifs anioniques et

non ioniques (agent mouillant) 2,5%

- lignosulfonate de sodium (agent dispersant) 5%

- argile kaolinique (support inerte) 42,5%

Exemple V-4 : granules dispersibles

Exemnle GDI

Dans un melangeur, on melange 90 % en poids de mature active et 10 % d'uree
en perles. Le melange est ensuite broy£ dans un broyeur a broches. On obtient une
30 poudre que Ton humidifie avec environ 8 % en poids d'eau. La poudre humide est
extrudee dans une extrudeuse k rouleau perform. On obtient un granule qui est sech6,
puis concasse et tamise, de fa9©n a ne garder respectivement que les granules d'une
dimension comprise entre 150 et 2000 microns.
Exemnle GD2

35 Dans un melangeur, on melange les constituants suivants :

- matiere active 15%

- agent mouillant (alkylnaphtalene sulfonate de sodium) 2%

- agent dispersant (polynaphtalene sulfonate de sodium) 8%

- charge inerte insoluble dans Teau (kaolin) 15%

• • •

Ce melange est granule en lit fluide, en presence d'eau, puis seche, concasse et
tamise de maniere a obtenir des granules de dimension comprise entre 0,15 et 0,80 mm.

5 Exemple V-5 : compositions pharmaceutiques

Exemple A: comprimes

On prepare, selon la technique habituelle, des comprimes doses a 50 mg de
peptide actif ayant la composition suivante:

- peptide heliomycine Ml 50 mg
10 - amidon 60 mg

- lactose 50 mg

- stearate de magnesium 2 mg

Exemple B: solution injectable
1 5 On prepare une solution injectable contenant 20 mg de peptide actif ayant

la composition suivante:

- peptide heliomycine M 2 22,4 mg

- eau distillee q.s.p. 2 cm^

REFERENCES

Ausubel, F. A. & coll. (eds. Greene). Current Protocols in Molecular Biology. Publ. Wiley
& Sons.

25 Bevan, M. & coll. (1983). Nuc. Acids Res. 11:369-385.
Carrington and Freed (1990). J. Virol. 64:1590-1597.

Ehret-Sabatier & coll. (1996) The Journal of Biological Chemistry, 271, 47, 29537-29544.
Horsch & coll. (1985). Science 227:1229-1231.
Jefferson & coll. (1987). EMBO J. 6:3901-3907.
30 Komari & coll. (1986). J. Bacteriol. 166:88-94.

Rothstein & coll. (1981). Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 45: 99-105.
Stalker & coll. (1988). J. Biol. Chem. 263:6310-6314.
Odell, J.T. & coll. (1985). Nature 313:810-812.

LISTE DE SEQUENCES
(1) INFORMATIONS GENE RALES :

(iii) NOMBRE DE SEQUENCES : 12

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:

(A) LONGUEUR: 147 paires de bases

(B) TYPE : nucleotide

(D) CONFIGURATION: lineaire

(ii) TYPE DE MOLECULE : ADN

(ix) CARACTERISTIQUE :

(A) NOM/CLE: CDS ...

(B) EMPLACEMENT : 1 . .147

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO : 1:

AGC TTG GAT AAA AGA GAC AAG TTG ATT GGC AGC TGT GTT TGG GGC GCC
Ser Leu Asp Lys Arg Asp Lys Leu lie Gly Ser Cys Val Trp Gly Ala
1 5 10 15

GTC AAC TAC ACT AGT GAC TGC AAC GGC GAG TGC AAG CGC CGC GGT TAC
Val Asn Tyr Thr Ser Asp Cys Asn Gly Glu Cys Lys Arg Arg Gly Tyr
20 25 30

AAG GGT GGC CAT TGT GGA TCC TTC GCT AAC GTT AAC TGT TGG TGT GAA
Lys Gly Gly His Cys Gly Ser Phe Ala Asn Val Asn Cys Trp Cys Glu
35 40 45

ACC
Thr
49

( 2 ) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO : 2 :

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:

(A) LONGUEUR: 169 paires de bases

(B) TYPE: nucleotide

(D) CONFIGURATION: lineaire

(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN

(ix) CARACTERISTIQUE :

(A) NOM/CLE: CDS

(B ) EMPLACEMENT : 1 . . 13 2

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:

GAT AAG CTT ATC GGT TCC TGC GTG TGG GGT GCT GTG AAC TAC ACT TCC
Asp Lys Leu lie Gly Ser Cys Val Trp Gly Ala Val Asn Tyr Thr Ser
15 10 15

GAT TGC AAC GGT GAG TGC AAG AGG AGG GGT TAC AAG GGT GGT CAC TGC
Asp Cys Asn Gly Glu Cys Lys Arg Arg Gly Tyr Lys Gly Gly His Cys
20 25 30

GGT TCC TTC GCT AAC GTG AAC TGC
Gly Ser Phe Ala Asn Val Asn Cys
35 40

TGG TGC GAG ACT TGAGAGCTCG
Trp Cys Glu Thr

GCGAGGCGAA CGTGTCGACG GATCCGG

(

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 3:

(i) CARACTERI STIQUES DE LA SEQUENCE:

(A) LONGUEUR: 261 paires de bases

(B) TYPE: nucleotide

(D) CONFIGURATION: lineaire

(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN

(ix) C ARACTER I S T I QUE :

(A) NOM/CLE: CDS

(B) EMPLACEMENT : 3 . .22 4

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3:

CC ATG GGT TTC GTG CTT TTC TCT CAG CTT CCA TCT TTC CTT CTT GTG
Met Gly Phe Val Leu Phe Ser Gin Leu Pro Ser Phe Leu Leu Val
15 10 15

TCT ACT CTT CTT CTT TTC CTT GTG ATC TCT CAC TCT TGC CGT GCC GAT
Ser Thr Leu Leu Leu Phe Leu Val lie Ser His Ser Cys Arg Ala Asp
20 25 30

AAG CTT ATC GGT TCC TGC GTG TGG GGT GCT GTG AAC TAC ACT TCC GAT
Lys Leu lie Gly Ser Cys Val Trp Gly Ala Val Asn Tyr Thr Ser Asp
35 40 45

TGC AAC GGT GAG TGC AAG AGG AGG GGT TAC AAG GGT GGT CAC TGC GGT
Cys Asn Gly Glu Cys Lys Arg Arg Gly Tyr Lys Gly Gly His Cys Gly
50 55 60

TCC TTC GCT AAC GTG AAC TGC TGG TGC GAG ACT TGAGAGCTCG GCGAGGCGAA
Ser Phe Ala Asn Val Asn Cys Trp Cys Glu Thr
65 70

CGTGTCGACG GATCCGG

2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 4:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:

(A) LONGUEUR: 120 paires de bases

(B) TYPE: nucleotide

(D) CONFIGURATION: lineaire

(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN

( ix) CARACTERISTIQUE :

(A) NOM/CLE : CDS

(B) EMPLACEMENT : 12

101

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO : 4:

GCGTCGACGC G ATG GGT TTC GTG CTT TTC TCT CAG CTT CCA TCT TTC CTT
Met Gly Phe Val Leu Phe Ser Gin Leu Pro Ser Phe Leu
1 5 10

CTT GTG TCT ACT CTT CTT CTT TTC CTT GTG ATC TCT CAC TCT TGC CGT
Leu Val Ser Thr Leu Leu Leu Phe Leu Val lie Ser His Ser Cys Arg
15 20 25

GCT GGAGACGCGA ATTCACACA
Ala
30

129

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 5:

(i) CARACTERI STIQUES DE LA SEQUENCE:

(A) LONGUEUR: 75 paires de bases

(B) TYPE: nucleotide

(D) CONFIGURATION: lineaire

(ii) TYPE DE MOLECULE : Autre acide nucleique

(A) DESCRIPTION: /desc = "oligonucleotide synthetique 7"

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO : 5:

GCGTCGACGC GATGGGTTTC GTGCTTTTCT CTCAGCTTCC ATCTTTCCTT CTTGTGTCTA 60

CTCTTCTTCT TTTCC 7 5

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 6:

(i) CARACTERI STIQUES DE LA SEQUENCE:

(A) LONGUEUR: 72 paires de bases

(B) TYPE : nucleotide

<C) NOMBRE DE BR INS : simple
(D) CONFIGURATION: lineaire

(ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucleique

(A) DESCRIPTION: /desc « "oligonucleotide synthetique 8"

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 6:

TCGCCGGCAC GGCAAGAGTA AGAGATCACA AGGAAAAGAA GAAGAGTAGA CACAAGAAGG 60

AAAGATGGAA GC 72

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 7:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:

(A) LONGUEUR: 80 paires de bases

(B) TYPE: nucleotide

(D) CONFIGURATION: lineaire

(ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucl£ique

(A) DESCRIPTION: /desc = 11 oligonucleotide synthetique 9

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 7:

GATAAGCTTA TCGGTTCCTG CGTGTGGGGT GCTGTGAACT ACACTTC CGA TTGCAACGGT
GAGTGCAAGA GGAGGGGTTA

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 8:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:

(A) LONGUEUR.: 109 paires de bases

(B) TYPE: nucleotide

(D) CONFIGURATION: lineaire

(ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucleique

(A) DESCRIPTION: /desc = "oligonucleotide synthetique 10

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 8:

CCGGATCCGT CGACACGTTC GCCTCGCCGA GCTCTCAAGT CTCGCACCAG CAGTTCACGT
TAGCGAAGGA AC CGCAGTGA CCACCCTTGT AACCCCTCCT CTTGCACTC

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 9:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:

(A) LONGUEUR: 85 paires de bases

(B) TYPE: nucleotide

(D) CONFIGURATION: lineaire

(ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucleique

(A) DESCRIPTION: /desc = "oligonucleotide synthetique 11

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 9:

AGGGCCCCCT AGGGTTTAAA CGGC CAGTC A GGCCGAATTC GAGCTCGGTA CCCGGGGATC
CTCTAGAGTC GACCTGCAGG CATGC

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 10:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:

(A) LONGUEUR: 66 paires de bases

(B) TYPE: nucleotide

(D) CONFIGURATION: lineaire

(ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucleique

(A) DESCRIPTION: /desc = "oligonucleotide synthetique 12"
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 10:
CCCTGAACCA GGCTCGAGGG CGCGCCTTAA TTAAAAGCTT GCATGCCTGC AGGTCGACTC '
TAGAGG . .

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 11:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:

(A) LONGUEUR: 93 paires de bases

(B) TYPE: nucleotide

(D) CONFIGURATION: lineaire

(ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucleique

(A) DESCRIPTION: /desc - "oligonucleotide synthetique 13"

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 11:

CCGGCCAGTC AGGCCACACT TAATTAAGTT TAAACGCGGC CCCGGCGCGC CTAGGTGTGT

GCTCGAGGGC CCAACCTCAG TACCTGGTTC AGG

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 12:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:

(A) LONGUEUR: 93 paires de bases

(B) TYPE: nucleotide

(D) CONFIGURATION: lineaire

(ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucleique

(A) DESCRIPTION: /desc = "oligonucleotide synthetique 14"

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 12:

CCGGCCTGAA CCAGGTACTG AGGTTGGGCC CTCGAGCACA CACCTAGGCG CGCCGGGGCC

GCGTTTAAAC TTAATTAAGT GTGGCCTGAC TGG

REVINDICATIONS

1 . Peptide comprenant essentiellement la sequence peptidique de formule (I),
Xaa-Cys-Xab-Cys-Xac-Cys-Xad-Cys-Xae-Cys-Xaf-Cys-Xag

5 (I)
dans laquelle:

Xaa est -NH2 ou un reste peptidique comprenant de 1 & 10 acides amines, de
preference de 1 a 6 acides amines,

Xab est un reste peptidique comprenant de 1 a 10 acides amine, de preference 10,
10 Xac est un reste peptidique comprenant de 3 acides amines,

Xad est un reste peptidique comprenant de 1 a 9 acides amines, de preference 9,
Xae est un reste peptidique comprenant de 1 a 7 acides amines, de preference 7,
Xaf est un reste peptidique de 1 acide amin£, et

Xag est -OH ou un reste peptidique comprenant de 1 a 5 acides amines, de
15 preference 1 ou 2 acides amines.

2. Peptide selon la revendication 1, caracterise en ce que

Xaa represente la sequence peptidique suivante Xaa'-Gly-Xaa"- dans laquelle Xaa'
represente NH2 ou un reste peptidique comprenant 1 a 9 acides amines, de preference 1 a
5 acides amines, et Xaa" represente un reste peptidique comprenant au moins un acide

20 amine, choisi de preference parmi Leu, He, Val, Pro, Ser ou Thr, et/ou

Xab represente la sequence peptidique suivante -Val-Xab'-Asp-, dans laquelle Xab*
represente un reste peptidique comprenant de 0 a 8 acides amines, de preference 8, et/ou
Xac represente la sequence peptidique suivante -Asn-Xac'-Glu-, dans laquelle Xac'
represente un reste peptidique comprenant un acide amine, et/ou

25 Xad represente la sequence peptidique suivante -Lys-Xad'-Gly-His-, dans laquelle Xad'
represente un reste peptidique comprenant de 0 a 6 acides amines, de preference 6, et/ou
Xae represente la sequence peptidique suivante -Gly-Xae'-Asn-, dans laquelle Xae'
represente un reste peptidique comprenant de 0 a 5 acides amines, de preference 5, et/ou
Xaf represente Tun des acides amines suivants Trp, Phe, Leu, He ou Val, et/ou

30 Xag represente la sequence peptidique suivante -Glu-Xag' dans laquelle Xag' represente
OH ou un reste variable de sequence comprenant de 1 k 4 acides amines, de preference 1
acide amine.

3. Peptide selon l'une des revendications 1 ou 2, caracterise en ce que

Xaa ou Xaa* comprennent au moins un acide amine basique, et/ou
Xad ou Xad' comprennent au moins un acide amine basique.

4. Peptide selon la revendication 3, caracterise en ce que Xad ou Xad'
comprennent 1, 2, 3 ou 4 acides amines basiques.
5 5. Peptide selon Tune des revendications 3 ou 4, caracterise en ce que les

acides amines basiques sont choisis parmi la lysine, I'arginine ou Thomoarginine.

6. Peptide selon Tune des revendications 1 a 5, caracterise en ce que
Xaa represente la sequence peptidique suivante NH2-Asp-Lys-Leu-Ile-Gly-Ser-, et/ou
Xab represente la sequence peptidique suivante -Val-Trp-Gly-Ala-Val-Asn-Tyr-Thr-Ser-

10 Asp-, et/ou

Xac represente la sequence peptidique suivante -Asn-Gly-Glu-; et/ou

Xad represente la sequence peptidique suivante -Lys-Arg-Arg-Gly-Tyr-Lys-Gly-Gly-His-,

et/ou

Xae represente la sequence peptidique suivante -Gly-Ser-Phe-Ala-Asn-Val-Asn-, et/ou
1 5 Xaf represente r acide amine suivant -Trp-, et/ou

Xag represente la sequence peptidique suivante -Glu-Thr-OH.

7. Peptide selon Tune des revendications 1 a 6, caracterise en ce qu'il est
represente par i'identiflcateur de n° 2 (SEQ ID No 2).

8. Peptide selon Tune des revendications 1 a 7, caracterise en ce qu'il
20 comprend a Tune ou l'autre de leurs extr&nites, ou les deux, des residus peptidiques

necessaires a son expression et ciblage dans un organisme hote.

9. Peptide selon Tune des revendications 1 a 8, caracterise en ce que les
residus cysteines du peptide de formule (I) forment au moins un pont disulfure
intramoleculaire.

25 10. Peptide de fusion « peptide-heliomicine », caracterise en ce que

Theliomicine est un peptide defini selon l'une des revendications 1 a 9.

1 1 . Peptide de fusion selon la revendication 10, caracterise en ce que le peptide
fusionne a Theliomicine est un peptide signal ou un peptide de transit.

12. Peptide de fusion selon la revendication 1 1, caracterise en ce que le peptide
30 de transit est le peptide signal du gene PR- la du tabac ou le precurseur du facteur Mat

alpha 1..

13. Peptide de fusion selon la revendication 12, caracterise en ce qu'il est
represente par Tidentificateur de sequence n° 1 (SEQ ID No 1) ou par l'identificateur de

sequence n° 3 (SEQ ID No 3).

14. A titre de medicament, le peptide selon Tune des revendications 1 a 1 3.

15. Composition caracterisee en ce qu'elle comprend le peptide selon Tune des
revendications 1 a 13 et un vehicule approprie.

16. Fragment d'acide nucleique, caracterise en ce qu'il comprend une sequence
d'acide nucleique codant pour un peptide selon Tune des revendications 1 & 13.

17. Fragment d'acide nucleique selon la revendication 14, caracterise en ce
qu'il s'agit d'une sequence nucleotidique de type ADN.

18. Fragment d'acide nucleique selon la revendication 15, caracterise en ce que
la sequence nucleotidique de type ADN comprend la sequence d'ADN decrite par les
bases 1-6 a 147 de l'identificateur de sequence n° 1 (SEQ ID NO 1) ou par l'identificateur
de sequence n° 2 (SEQ ID NO 2) une sequence homologue ou une sequence
complementaire de ladite sequence.

19. Fragment d'acide nucleique selon la revendication 15, caracterisee en ce
que la sequence nucleotidique de type ADN comprend la sequence d'ADN decrite par
1'identificateur de sequence n° 1 (SEQ ID NO 1) ou par l'identificateur de sequence n° 3
(SEQ ID NO 3), une sequence homologue ou une sequence complementaire de ladite
sequence.

20. Gene chimere comprenant une sequence codante ainsi que des elements de
regulation en position 5' et 3' heterologues pouvant fonctionner dans un organisme hote, en
particulier les plantes, caracterise en ce que la sequence codante comprend au moins un
fragment d'ADN tel que defini dans les revendications 16 a 19.

21. Gene chimere selon la revendication 20, caracterise en ce que 1' organisme
hote est un microorganisme.

22. Gene chimere selon la revendication 20, caracterise en ce que 1'organisme
hote est choisi parmi les cellules vegetales et les plantes.

23. Vecteur de clonage ou d'expression pour la transformation d'un organisme
hote caracterise en ce qu'il comprend au moins une origine de replication et au moins un
gene chimere tel que defini dans les revendications 20 a 22.

24. Vecteur selon la revendication 23, caracterise en ce qu'il s'agit d'un virus
employ^ pour la transformation des plantes developp&s et contenant en outre ses propres
elements de replication et d'expression.

25. Vecteur selon la revendication 23, caracterise en ce qu'il s'agit d'un

0 39 #

plasmide.

26. Organismes hotes transformes, caracterises en ce qu'ils contiennent un
fragment d'acide nucleique selon les revendications 16 a 19, ou un gene chimere selon les
revendications 20 a 22.

27. Organisme hote transforme selon la revendication 26, caracterise en ce qu'il
s'agit de micro organismes, de cellules vegetales ou de plantes.

28. Organisme hote transforme selon la revendication 27, caracterise en ce qu'il
s'agit d'une plante contenant des cellules transformees.

29. Organisme hote selon la revendication 28, caracterise en ce que la plante est
regeneree a partir des cellules transformees.

30. - Organisme h6te transforme selon la revendication 27, caracterise en ce que
le microorganisme est choisi parmi les bacteries, en particulier E. coli, les levures, en
particulier des genres Saccharomyces ou Kluyveromyces, Pichia, les champignons, en
particulier Aspergillus, ou lesn bacilovirus,

31. Cellule vegetale transformee, caracterisee en ce qu'elle contient un
fragment d'acide nucleique selon les revendications 16 a 19 ou un gene chimere selon les
revendications 20 a 22.

32. Plante transformee resistante aux maladies, caracterisee en ce qu'elle
comprend au moins une cellule vegetale transformee selon la revendication 31.

33. Plante transformee selon la revendication 32, caracterisee en ce qu'elle est
resistante aux maladies causees par Cercospora, en particulier Cercospora beticola,
Cladosporium en particulier Cladosporium herbarum, Fusarium, en particulier Fusarium
culmorum ou Fusarium graminearum, ou par Phytophthora, en particulier Phytophtora
cinnamomi.

34. Plante transformee resistante aux maladies, caracteris6e en ce qu'elle est
issue de la culture et/ou du croisement des plantes selon Tune des revendications 32 ou 33.

35. Graines de plantes transformees selon Tune des revendications 32 k 34.

36. Procede de transformation des organismes hotes, en particulier des cellules
vegetales ou des plantes, caracterise en ce que Ton insere dans ledit organisme hote au
moins un fragment d'acide nucleique selon les revendications 16 a 19 ou un gene chimere
selon Tune des revendication 20 k 22.

37. Procede de transformation des plantes pour les rendre resistantes aux
maladies fongiques ou bacteriennes, caracterise en ce que Ton insere dans la plante au

moins un fragment d'acide nucleique selon les revendications 16 a 19 ou un gene chimere
selon les revendications 20 a 22.

38 Procede de culture des plantes transformees selon Tune des revendications
32 a 35, caracterise en ce qu'il consiste k planter les graines des dites plantes transformees
dans une surface d'un champ approprte pour la culture des dites plantes, k appliquer sur la
dite surface du dit champ une composition agrochimique, sans affecter de maniere
substantielle les dites graines ou les dites plantes transformees, puis a recolter les plantes
cultivees lorsqu'elles arrivent a la maturite souhaitee et eventuellement a separer les
graines des plantes recoltees.

39. Procede de culture selon la revendication 38, caract6ris6 en ce que la
composition agrochimique comprend au moins un produit actif ayant au moins une
activite fongicide et/ou bactericide.

40. Procdde de culture selon la revendication 39, caracterise en ce que le
produit actif presente une activite complementaire de celle du peptide selon Tune des
revendications 1 a 13.

41. Procede de preparation d'heliomicine definie selon Tune des revendications
1 a 13, caracterise en ce qu'il comprend comprenant les etapes de culture d'un organisme
transforme selon Tune des revendications 26 ou 30 dans un milieu de culture approprie,
puis Textraction et la purification totale ou partielle de Theliomicine obtenue.

sequence n° 3 (SEQ ID No 3). ^c^ e *

14. A titre de medicament, le peptide selon Tune des revendications 1 a 13.

15. Composition caracterisee en ce qu'elle comprend le peptide selon Tune des
revendications 1 a 13 et un vehicule approprie.

5 16. Fragment d'acide nucleique, caracterise en ce qu'il comprend une sequence

d'acide nucleique codant pour un peptide selon Tune des revendications 1 a 13.

17. Fragment d'acide nucleique selon la revendication 16, caracteris6 en ce
qu'il s'agit d'une sequence nucleotidique de type ADN.

18. Fragment d'acide nucleique selon la revendication 17, caracterise en ce que
10 la sequence nucleotidique de type ADN comprend la sequence d'ADN decrite par les

bases 16 a 147 de ridentificateur de sequence n° 1 (SEQ ID NO 1) ou par Tidentificateur
de sequence n° 2 (SEQ ID NO 2) une sequence homologue ou une sequence
complementaire de ladite sequence.

19. Fragment d'acide nucleique selon la revendication 17, caracterisee en ce
15 que la sequence nucleotidique de type ADN comprend la sequence d'ADN decrite par

1'identificateur de sequence n° 1 (SEQ ID NO 1) ou par l'identificateur de sequence n° 3
(SEQ ID NO 3), une sequence homologue ou une sequence complementaire de ladite
sequence.

20. Gene chimere comprenant une sequence codante ainsi que des elements de
20 regulation en position 5' et 3' heterologues pouvant fonctionner dans un organisme h6te, en

particulier les plantes, caracterise en ce que la sequence codante comprend au moins un
fragment d'ADN tel que defini dans les revendications 16 a 19.

21. Gene chimere selon la revendication 20, caracterise en ce que Torganisme
hote est mi microorganisme.

25 22. Gene chimere selon la revendication 20, caracterise en ce que l'organisme

hote est choisi parmi les cellules vegetales et les plantes.

employe pour la transformation des plantes developpees et contenant en outre ses propres
elements de replication et d'expression.

25. Vecteur selon la revendication 23, caracterise en ce qu'il s'agit d'un

1/2

HinDIII

oligonucleotide 1

GGATAAAAGAGACAAGTTGATTGGCAGCTGTGTTTGGGGCGCCGT

ACCTATTTTCTCTGTTCAACTAACCGTCGACACAAACCCCGCGGCA

oligonucleotide 2—

SLDKRDKL IGSCVWGAV

— - — oligonucleotide 3

CJjACTACACTAGTGACTGCAACGGCGAGTGCAAGCGCCGCGGTTACAAGG 1

+ 0

GTTGATG'

VCTGACGTTGCCGCTCACGTTCGCGGCGCCAATGTTCC 0

=— = — • oligonucleotide 4 —

NYTSDCNGECKRRGYK

tTGajr^c

oligonucleotide 5

GTO^C^TTGTGGATCCTTCGCTAACGTT 1

+ 5

CACCGGTAAC AQCTAGGAAGC GATTGCAATTGACAACC ACACTTTGGACT 0

— oligonucleotide 6

GGHCGSFANVNCWCET Stop

Sa il p>

TAGfrTCGACfc

■ i i i 1
ATCCAGC

Stop

T drCTAGl

164

Bglll

Fig.l

TEV 5' UTR
| CaMV 2x35S Promoterj^j

BamHI, Xbal Pstl, SphI, Hindlll

=1=

Ncol

GUS

CaMV polyA

Hindlll, SphI, Pstl, Smal

Fig. 2

2/2

TEV

2X 35S promoter

PR-1a-heliomicine

CaMVpolyA

Fig. 3

[

Art S6I
/pal Pme I
J 1 I l_

W Xxl Sfrl Asc ,
SecI BenHI Rti p^, ^
EooRI Shrsl Sail HrtJIII Xhol
-I 1 >l II I II I I l i i

pRPA-RD-195

133 base pairs
Fig. 4

UHque Sites

DEES

35S pro £ BRXgene

Hrtill Fist I, Sail, Xbal, BamH, Anal, Kpnl, Sad. &oR, Xml

Fig. 5

NPT II

NOSpro | | 35S pro jfgRTg

ene

HindlH, Sphl, Pstt, Sail, Xbal, BamHI, Eco/V* Apal, Xhol, Avrll, Ascll, Pmel, Pad, Sfil

Fig. 6

Internet Archive Audio

Featured

Top

Images

Featured

Top

Software

Featured

Top

Books

Featured

Top

Video

Featured

Top

Mobile Apps

Browser Extensions

Archive-It Subscription

Save Page Now

Full text of "USPTO Patents Application 09673274"

See other formats